1. Nguyên lý:
-
Kỹ thuật PCR: là kỹ thuật sinh học phân tử (SHPT) cho phép nhân bản một đoạn
DNA mong muốn từ hệ gen
DNA của cơ thể sinh vật thành nhiều bản sao. Kết quả chu kì cuối được phân tích bằng điện di.
Các sản phẩm của quá trình chạy PCR được gắn với huỳnh quang và dựa vào ngưỡng phát hiện huỳnh quang (sớm hay muộn) mà người làm thí nghiệm sẽ biết được số lượng DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng.
Sau PCR, sử dụng điện di trên gel agarose/ thực hiện thí nghiệm lai với đoạn dò đặc hiệu để xác định sản phẩm khuyếch đại.
2. Các biểu đồ:
Biểu đồ 1: Biểu đồ khuếch đại
Biểu đồ 1: Biểu đồ một đường biểu diễn khuếch đại ghi nhận cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận được ánh sánh kích thích vào mỗi chu kỳ nhiệt
- Trục tung: biểu diễn cường độ huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng khi nhận ánh sáng kích thích.
- Trục hoành: biểu diễn số chu kỳ nhiệt.
-
Đường nền (baseline): được định nghĩa là số chu kỳ
PCR trong đó tín hiệu huỳnh quang đặc hiệu tích lũy dần nhưng chưa đạt ngưỡng nhận biết của thiết bị. Theo mặc định, đường nền được xác lập trong khoảng chu kỳ 3 đến 15 và có thể được thay đổi.
- Cường độ huỳnh quang nền: TB cộng của cường độ huỳnh quang xuất hiện trong ống phản ứng trong 1 số chu kỳ đầu.
- Chu kỳ ngưỡng (Ct): là chu kỳ nhiệt mà ở tại thời điểm đó, thiết bị Realtime ghi nhận được tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng bắt đầu vượt qua cường độ huỳnh quang nền.
Để real-time PCR xác định được chính xác số lượng bản đích ban đầu có trong mẫu thử, phải thực hiện real-time PCR các mẫu thử chứa các số lượng bản DNA đích ban đầu cần xác định số lượng cùng lúc với các mẫu chuẩn chứa số lượng DNA đích ban đầu đã biết rõ số lượng
Biểu đồ đường biểu diễn chuẩn - Standard curve
Đường biểu diễn vẽ lên mối quan hệ giữa chu kỳ ngưỡng với số lượng bản DNA đích ban đầu có trong các mẫu chuẩn được gọi là đường biểu diễn chuẩn.
3. Các loại hóa chất và cách đọc kết quả cho realtime-PCR:
Các loại hóa chất:
3.1. Chất phát huỳnh quang là một loại màu huỳnh quang chèn vào sợi đôi DNA(SYBR)
Cơ chế hoạt động:
- Khi chưa có sản phẩm khuyếch đại thì ống nghiệm không phát được huỳnh quang khi nhận ánh sáng kích thích.
- Nhưng khi có sản phẩm khuyếch đại thì SYBR 1 chèn vào và tập trung trên phân tử DNA làm cho ống phản ứng phát quang khi nhận ánh sáng kích thích.
SYBR Green I:
Đặc điểm của SYBR Green:
- Tính đặc hiệu không cao
- Tầm soát sản phẩm trước khi sử dụng probe đặc hiệu
- Thực hiện khi PCR đã được tối ưu hóa, không có primer dimer
Để khắc phục nhược điểm của SYBR I, sử dụng Melting Curve có thể phân biệt được sản phẩm khuyếch đại từ DNA đích hay từ dimer primer dựa vào nhiệt độ chảy
3.2. Sử dụng probe làm chất phát huỳnh quang:
3.2.1 Taqman Probe:
3.2.2 Beacon Probe
3.2.3 Probe lai
Cách đọc kết quả realtime-PCR
Kết quả định tính:
Mẫu âm tính:
Mẫu dương tính:
Mẫu xét nghiệm
Mẫu chứng dương
Kết quả định lượng:
Mẫu dương tính dưới ngưỡng phát hiện
Mẫu dương tính: 1.25 x 105 copies/ml
4. Ứng dụng
-
Kỹ thuật PCR định lượng được ứng dụng rộng rãi trong nghiên cứu, chẩn đoán và đánh giá hiệu quả của điều trị.
- Đánh giá sự biểu hiện của các gen trong tế bào ở mức độ RNA.
- Phát hiện và định lượng các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, virus và nấm phục vụ cho việc chẩn đoán và điều trị.
- Xác định đột biến gen với các cặp mồi đặc hiệu cho từng đột biến.
- Xác định các đa hình thái đơn (SNPs) với các cặp mồi đặc hiệu.
